樟芝三萜類化合物文獻

什麼是三萜類化合物呢?它又具有什麼具體功效呢?

三萜類化合物是自然界常被發現的天然化合物,尤其以植物含量最多,大多是由30 個碳原子組成,屬於次級代謝物。樟芝剛被發現的時候,被誤以為是靈芝的一種,它的醫療效果也常被用來和靈芝比較。含三萜類成分的植物有靈芝、牛樟芝及巴西蘑菇等,其中以牛樟芝含量最高。實驗證明,靈芝內大約含有20-50多種三萜類指紋,各種靈芝總計發現兩百多種三萜類指紋,而牛樟芝單一種就有二百多種三萜類指紋,含量之多是靈芝的數多倍。目前研究發現,品質較好的靈芝三萜類含量大約為1%—3%,而牛樟芝一種三萜類含量就達8%—15%。因此,牛樟芝被稱為「靈芝之王」。到目前為止,研究人員在樟芝中總共分離鑒定出了35 種具有抗炎作用的化合物,包括三萜類化合物、琥珀/馬來酸衍生物、苯環型化合物、苯醌衍生物、多糖和其它化合物,其中以三萜類化合物的數量最多( 11 種) 且有顯著的抗炎作用。

 

事實上,樟芝中三萜類化合物和靈芝中三萜類化合物是不盡相同的,靈芝中主要以羊毛甾烷類( lanostanes) 三萜為主,而樟芝中則含有較多的麥角甾烷類( ergostanes) 三萜。羊毛甾烷類的三萜也常在其它真菌中被發現,而麥角甾烷三萜類化合物則比較罕見,可作為鑒定樟芝的指標成分。三萜類化合物與膽固醇和類固醇激素的結構非常相似,故其或能通過模擬類固醇激素或干擾膽固醇的代謝來發揮抗炎效應。

 

三萜類化合物不僅能抑制癌細胞的生長,抑制組織胺的釋放,還具有防止過敏,保護肝臟,促進血小板凝集、降低血脂等功能。三萜類含量越高則醫用價值越高。實驗證實,高血壓患者因為血壓高,導致腦血管破裂而中風,三萜類物質中的ACE活性成分可以有效降低血壓,從而達到預防中風的目的。另外三萜類化合物還具有抗發炎之功效,对炎症的預防和治療對延緩許多癌症,如胃癌、結腸癌、肝癌、胰腺癌等的發生和發展都有積極的作用。而一些天然藥物也因其具有預防和治療炎症的功能而備受關注。

樟芝三萜類化合物的抗炎和抗癌作用

炎症是許多病理狀態中機體對有害刺激的應答。例如,一些腫瘤在發生前或發生時常有慢性炎症。據報導,慢性炎症與1 /4 以上的腫瘤發生相關,相當於全世界每年約320 多萬人罹患炎症相關的腫瘤。如石棉吸入與間皮瘤,二氧化矽吸入、吸煙、支氣管哮喘與支氣管癌,宮頸炎、HPV 感染與宮頸癌,盆腔炎及卵巢上皮炎症與卵巢癌,EB 病毒感染與鼻咽癌,HIV 感染與凱西波肉瘤,返流性食管炎與食管癌,幽門螺旋桿菌感染相關性胃炎與胃癌,慢性胰腺炎與胰腺癌,慢性肝炎與肝細胞癌,炎症性腸病與結直腸癌等。

三萜化合物抗炎活性的研究

 嗜中性粒細胞中活性氧簇( reactive oxygen species, ROS) 的生成和細胞牢固黏附是2 種在發炎期間表現出的重要炎症應答。為了確定樟芝中4 種麥角甾烷類三萜化合物zhankuic acid A、B、C( 即antcinB、I、H) 和antcin K 是否能防止嗜中性粒細胞引起的炎症應答,Shen 等評估了這些化合物對甲醯甲硫氨醯-亮氨醯-苯丙氨酸( formylmethionyl leucyl phenylalanine,FMLP) 和卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯( phorbolmyristate acetate,PMA) 活化的外周人嗜中性粒細胞的影響。

用1 ~ 25 μmol /L 的zhankuic acid A、B、C或antcin K 進行預處理,通過化學發光實驗分析,發現fMLP 或PMA 誘導的ROS 生成表現出濃度依賴性 減少,所對應的IC50值在5 ~ 20 μmol /L 之間。再者, zhankuic acid A、B、C 或antcin K 還顯著抑制了fMLP 或PMA 誘導的細胞牢固黏附,並且沒有干擾Mac-1( CD11b /CD18) 表面蛋白( 一種介導嗜中性粒細胞對內皮細胞牢固黏附的β2-整合素) 表達的上調。另外,這些物質所引起的抗炎作用並不是由於細胞毒性,因為與對照組相比,細胞活力沒有發生顯著變化。這些結果表明這幾種三萜化合物對嗜中性粒細胞ROS 生成和細胞牢固黏附的抑制沒有顯著的細胞毒性,即這幾種化合物可以作為臨床上潛在的抗炎藥物。

最近一項研究闡述了樟芝麥角甾烷類三萜抗炎作用的分子機理。研究人員從樟芝子實體中分離純化出5 種三萜類化合物antcin A、B、C、H、K,發現其中的antcin A 與糖皮質類激素可的松( cortisone) 和地塞米松( dexamethasone) 的化學結構最相似,見圖1。

圖1 糖皮質激素與5 種三萜化合物的化學結構式

 由於結構的相似,antcin A 導致了人肺腺癌細胞A549 中糖皮質激素受體( glucocorticoid receptor,GR)從細胞質中易位至細胞核。分子模型顯示,儘管它們C-17 位的端基有所不同,antcin A 以及糖皮質激素可以穩定地與GR 的結合腔反應。

 因此,antcinA 作為一種活性成分,可能是樟芝抗炎的至少一部分原因,其抗炎的分子機理與糖皮質激素誘導的分子機理相同,即antcin A 可以模擬糖皮質激素。由於antcin A 的親脂性,很容易擴散通過細胞膜,接著與細胞質的GR 結合。

 與antcin A 結合後,GR 與熱休克蛋白分離,然後GR/antcin A 複合物形成二聚物,最後易位至細胞核。在細胞核中,GR/antcin A 與目標基因的糖皮質激素反應元件( glucocorticoid responseelement,GRE) 結合,進而調控基因的表達,例如增加抗炎因數的表達,降低促炎因數的表達2

 此外,這5 種化合物中,只有antcin A 能夠模擬糖皮質激素,導致GR 的細胞核易位。Antcin A 和其它4種antcins 的主要區別在於後面這些三萜類化合物在它們的C-7 位置額外多了一個羰基或者羥基。分子模型表明antcin A 或者糖皮質激素的C-7 部位暴露於GR 結合腔的疏水域,因此其餘4 種C-7 位因為擁有額外親水基團的antcins 很可能當它們靠近GR 的時候被排斥[Footnote 2]。

然而,儘管體外實驗顯示這4 種antcins 未能導致GR 的細胞核易位,但它們有可能在體內通過模擬糖皮質激素產生抗炎作用,因為腸道菌群或者肝腸迴圈可能會將C-7 位的親水基團去除[Footnote 2]。

致病菌幽門螺旋桿菌( Helicobacter pylori,Hp) 是導致胃癌發生的首要危險因素。Hp 毒力因數,細胞毒素相關基因A(cytotoxin-associated gene A,Cag A)與富膽固醇的微區相互作用,導致胃黏膜上皮細胞產生炎症。

Lin 等發現從樟芝中提取出來的麥角甾烷類三萜化合物methyl antcinate B( MAB) 可以抑制CagA 的易位和磷酸化,50 μmol /L 的MAB 使其易位和磷酸化分別減少了52% 和60%,並引起HP感染的胃黏膜上皮細胞中蜂鳥表型的減少。MAB 還可以通過減弱NF-κB 的活化、p65 NF-κB 的易位和IκB-α 的磷酸化抑制Hp 誘導的炎症反應,這表明MAB 可以調控CagA 介導的信號通路[Footnote 3-2]]。

此外,MAB 也可以抑制Hp 感染的胃黏膜上皮細胞中IL-8螢光素酶的活性及其分泌。分子結構類比顯示MAB與CagA 相互作用,其方式與膽固醇相似。膽固醇與固定化的CagA 的結合因MAB 水準的增加而受到抑制[9]。這項研究表明MAB 能夠通過干擾膽固醇發揮抗炎效應,有望成為治療Hp CagA 誘導的炎症反應的候選藥物。

另一項關於樟芝抗炎的研究發現樟芝深層發酵液中的ergostatrien-3β-ol( ST1) 在大鼠體內具有抗炎和鎮痛作用。通過抗炎實驗發現,在λ-角叉菜膠( carrageenin,Carr) 處理4 h 和5 h 後,ST1 ( 10 mg /kg) 可以使大鼠腳爪的水腫減弱,而且使肝臟中過氧化氫酶( catalase,CAT) 、超氧化物歧化酶(super oxide dismutase,SOD) 和谷胱甘肽過氧化物酶( glutathione peroxidase,GP x) 的活性增加,同時ST1 可明顯降低Carr 處理5 h 後大鼠水腫的腳爪中丙二醛的含量。

ST1 (1、5 和10 mg /kg) 還可減少Carr 處理5h 後大鼠水腫腳爪裡血清腫瘤壞死因數α[Footnote 4]。蛋白印記實驗結果顯示ST1(10 mg /kg) 能減少5 h 後大鼠水腫爪子裡Carr 誘導的誘導型一氧化氮合酶 (inducible Nitric Oxide Synthase, iNOS) 和環氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2) 的表達。

 將ST1 以腹膜內注射形式對大鼠進行處理時,發現ST1 也可以減少嗜中性粒細胞浸潤到有炎症的部分,從而達到消炎鎮痛的效果[Footnote 4]。由此可以看出,ST1 可以通過對TNF-α 和ROS 促炎因數的抑制,增加肝臟中CAT、SOD 和GPx 的活性,來減少大鼠水腫腳爪中iNOS 和COX-2的水準。

進一步分析ST1 的化學結構( 圖2) ,可以發現ST1 的結構與膽固醇的結構非常相似,因此可以推測ST1 抗炎的分子機理可能與干擾膽固醇的作用有關。

 

 

圖2 ST1 化學結構式

除麥角甾烷類外,樟芝中的某些羊毛甾烷類三萜也被發現有抗炎活性。體外研究表明樟芝中的2種羊毛甾烷類三萜化合物eburicoic acid ( TR1) 和dehydroeburicoic acid ( TR2) 以劑量依賴的方式降低了fMLP 和PMA 誘導的外周人中性粒細胞中ROS 的生成,並且這種作用並不是由於細胞毒性效應引起的,因為相對於對照組來講,實驗組的細胞活力沒有顯著改變。

Deng 等進一步對這2 種三萜類化合物在小鼠體內的鎮痛和抗炎活性進行了測定。研究發現,TR1 和TR2 可以顯著抑制一系列醋酸誘導的扭體反應和福馬林誘導的後期疼痛。在抗炎實驗中,TR1和TR2 可以減輕在Carr 給藥4 h 和5 h 後的足腫脹,並且可以增加小鼠水腫組織中CAT、SOD 和GPx 的活性。

同時發現在Carr 給藥5 h 後,TR1 和TR2 可以明顯降低水腫腳爪或血清中的丙二醛( malondialdehyde,MDA) 、一氧化氮( nitric oxide,NO) 、TNF-α和白細胞介素-1β( interleukin-1β, IL-1β) 的水準。其中10 mg /kg 的TR1 使MDA、NO、TNF-α 和IL-1β 分別降低了48. 18%、35. 18%、53. 64% 和24. 81%,10mg /kg 的TR2 使其分別降低了56. 93%、45. 02%、62. 76%和32. 49%[11]。

蛋白印跡結果表明,TR1 和TR2 可以明顯降低Carr 給藥第5 h 後的水腫腳爪中iNOS 和COX-2 的表達,以及嗜中性粒細胞對水腫腳爪的浸潤[Footnote 6]。

以上結果表明,TR1 和TR2 的抗炎機制可能與炎症細胞因數的減少和抗氧化酶活性的增加有關。因此可以樟芝中的三萜類化合物能顯著降低促炎因數的表達,增加抗氧化酶的活性。由於樟芝中的三萜類化合物,尤其麥角甾烷類的結構與類固醇激素和膽固醇的結構相似,故其或能模擬類固醇激素,與其受體結合,易位至細胞核,調控基因表達,或者能干擾膽固醇的作用,從而發揮抗炎效應。

三萜化合物抗癌的研究

癌症是現今世界上因危疾死亡的主要原因。癌症可供選擇的治療方案有限並非常昂貴。因此採用有效的預防、控制和治療方法比較可取。大量臨床前動物研究確認很多種三萜類化合物對多種癌細胞和癌症有預防以及抗癌的功效。除了天然萃取的三萜化合物外、一些合成的三萜衍生物,包括氰基-3,12-二氧雜環戊烷-1,9(11) – 二烯-28-oic(CDDO),其甲酯(CDDO-Me),和咪唑化物(CDDO-Im)衍生物等都有臨床前證據確認合成三萜類化合物CDDO-Me的具有癌症預防和治療活性

經體內及體外研究牛樟抑制人類乳癌細胞繁殖

另外中國醫藥大學楊新玲研究團隊,通過體內及體外實驗發現牛樟芝萃取液能使人類乳癌細胞株MCF-7產生細胞凋亡作用並使凋亡細胞(Apoptotic cell) 的數量隨著使用量增加而增加。經過進一步以人類乳癌細胞株MDA-MB-231做試驗、發現增加濃度和延長用藥時間,能有效地抑制人類乳癌細胞株MDA-MB-231的存活率。

 

在同一試驗中,同時觀察裸鼠腫瘤體積和重量並和一組使用NS-398(COX-2 Inhibitor) 的腫瘤裸鼠作比較在於第0週於裸鼠皮下植入乳癌細胞MA-MB-231後,連續觀察五週。於第五週後,試驗結果顯示:(1) 牛樟芝在抑制癌細胞腫瘤增生上,呈現明顯的劑量与時間相關性。牛樟芝110mg/kg在抑制腫瘤增生上的效果非常顯著,甚至比乳癌用藥NS-398(COX-2抑制劑) 更好。和控制組比較,抑癌效果更明顯。

(2) 腫瘤重量

在五週後進行病理解剖,取出各組各七隻裸鼠的乳癌腫瘤並測量腫瘤大小和重量。從下圖實驗結果顯示牛樟芝110mg/kg在抗腫瘤擴散的效果明顯,這一組裸鼠七隻中有二隻己經成功抑制乳癌腫瘤,而其餘的腫瘤明顯小。其效果比乳癌用藥NS-398(COX-2抑制劑) 更好。

下圖是各組取出腫瘤平均重量:

牛樟芝110mg/Kg的組別中腫瘤重量是各組中最低。

三萜類dehydroeburicoic acid造成血癌細胞DNA損害和凋亡

另一組台灣科究人員在2012年在英國權威醫學雜誌Phytomedicine(植物醫學)發表了透過體內和體外的實驗研究從牛樟芝萃取含三萜類化合物的抑制血癌的效果和作用机制。首先通過乙醇萃取牛樟芝中含有豐富三萜類化合物部分(FEA-Ethyl acetate fraction);通過高效液相色譜儀(HPLC),從FEA中分離出五種主要的三萜類化合物表徵: antcin K(1),antcin C(2),zhankuic acid C(3),zhankuic acid A(4),和dehydroeburicoic acid脫氫硼酸(5)。實驗結果顯FEA可以使H2A.X和Chk2的磷酸化,導致HL 60血癌細胞中DNA損傷。透過增強PARP裂解和激活細胞凋亡有關caspase- 3這至癌細胞凋亡. 而在FEA主要成分的五種主要的三萜類化合物中,細胞毒性(1-5)研究表明脫氫樅酸(DeEA)是最有效的癌細胞毒恬。類似於FEA ,DeEA能激活DNA損傷和凋亡的生物標誌物(biomarker),同時也抑制拓撲異構酶II(topoisonmerase II)。在HL 60癌細胞移植動物模型中,DeEA處理導致腫瘤重量和太小顯著降低而沒有顯著減少小鼠體重。

 

隨著時間增加,由dehydroeburicoic acid脫氫樅酸(DeEA)作用而造成的癌細胞凋亡數字亦增加。

同時亦觀察到zhankuic acid A和dehydroeburicoic acid脫氫硼酸能造成PARP裂解而使癌細胞凋謝 (PARP(poly ADP-ribose polymerase)是DNA修復酶。PARP是細胞凋亡核心成員半胱天冬酶(caspase)的切割底物。因此,它在DNA損傷修復與細胞凋亡中發揮著重要作用)。[注:在細胞分裂過程中,當DNA出現不正常斷裂而需要修復時,PARP在修復過程中發揮作用。由於快速分裂的癌細胞發生DNA斷裂頻率較正常細胞為高,因此在PARP被裂解抑制的情況下,DNA損傷會在癌細胞內迅速累積造成癌細胞死亡。]

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